Shrnutí
Rezistence rostlin k chorobám je často složitý znak, který nemusí být řízen jediným genem. U brukvovité zeleniny, jako je brokolice, květák, zelí, kedluben nebo kapusta, je významnou chorobou plíseň brukvovitých, způsobená patogenem Hyaloperonospora parasitica. Moderní šlechtění proto hledá molekulární markery, které by mohly pomoci rychleji vybírat genotypy s vyšší odolností.
Jednou z možností je využití SNP markerů (z anglického single-nucleotide polymorphism) identifikovaných pomocí celogenomového asociačního mapování, tzv. GWAS. V praxi lze pro složité znaky testovat i rozsáhlé panely desítek až stovek SNP. V této pilotní fázi byla ověřována užší sada 24 kandidátních SNP, u nichž se testovalo, zda mohou pomoci rozlišit rezistentní a náchylné genotypy. Výsledky ukázaly, že některé polymorfismy se mezi genotypy lišily, ale nebyly jednoznačně specifické pouze pro rezistentní nebo pouze pro náchylné materiály. To potvrzuje, že kandidátní SNP je nutné vždy validovat na širším genetickém souboru.
Úvod
Plíseň brukvovitých patří mezi významné choroby druhů rodu Brassica. Napadá mladé rostliny i dospělé a může snižovat kvalitu i výnos produkce. Vedle agrotechnických opatření a chemické ochrany je proto důležitou cestou šlechtění odolnějších odrůd.
Rezistence k chorobám však bývá geneticky složitá. Na výsledné odolnosti se často podílí více úseků genomu, jejich vzájemné interakce, vývojové stadium rostliny, patotyp patogenu i podmínky prostředí. Proto je pro šlechtění užitečné hledat molekulární markery, které jsou s vyšší odolností statisticky spojeny.
Jedním z nástrojů pro hledání takových markerů je GWAS, tedy celogenomové asociační mapování. Tato metoda porovnává genetická data s fenotypem, například s hodnocením rezistence nebo náchylnosti k patogenu, a umožňuje vytipovat kandidátní SNP — místa v genomu, kde se genotypy liší jedním nukleotidem.
Od GWAS k laboratornímu ověření
Identifikace kandidátního SNP je ale pouze první krok. Aby mohl být polymorfismus využit jako praktický marker, je nutné ověřit, zda skutečně pomáhá rozlišit odolnější a náchylnější materiály.
V návaznosti na Horizon 2020 projekt BRESOV byly pro vybrané kandidátní SNP navrženy PCR primery, které amplifikují úsek genomu v okolí sledovaného polymorfismu. Následně byly navrženy SBE primery pro metodu Single Base Primer Extension, známou také pod komerčním označením SNaPshot. Princip je poměrně elegantní: primer nasedne těsně před místo SNP a v reakci se prodlouží právě o jeden nukleotid. Podle toho, který fluorescenčně značený nukleotid se do produktu zabuduje, lze určit, jaká báze se v dané pozici nachází.
Produkty se poté separují pomocí kapilární elektroforézy a vyhodnocují v softwaru pro fragmentační analýzu. Výsledkem je informace, zda má daný genotyp v konkrétní pozici například alelu A, C, G nebo T.
Pro ověření kandidátních SNP byla tak využita sada 24 párů PCR primerů pro redukci komplexity genomu a odpovídajících SBE primerů pro detekci konkrétní báze v místě SNP.
Co pilotní testování ukázalo
Pilotní ověřování probíhalo na souboru 16 vybraných genotypů Brassica oleracea z kolekce BRESOV, včetně referenčních standardů, zahrnujících různé typy brukvové zeleniny jako je květák, brokolice, kapusta, zelí, růžičková kapusta, kedluben a příbuzné plané formy. Nejprve bylo nutné pomocí agarózové elektroforézy ověřit, zda PCR primery skutečně amplifikují úseky očekávané délky.
Dalším krokem byla optimalizace SBE/SNaPshot reakce. Při ní se ukázalo, že skutečná délka výsledných produktů nemusí vždy přesně odpovídat délce očekávané podle návrhu primerů. Proto bylo nutné nejprve ověřovat jednotlivé SBE primery samostatně a teprve poté je spojovat do multiplexních reakcí. Multiplexování, tedy analýza více SNP v jedné reakci, sice šetří čas i náklady, ale zároveň zvyšuje nároky na interpretaci výsledků.
Následná analýza ukázala, že některé ze sledovaných SNP byly v testovaném souboru polymorfní, tedy že se mezi genotypy skutečně lišily. Tyto rozdíly však nebyly jednoznačně vázané pouze na rezistentní nebo pouze na náchylné materiály. Odlišný nukleotid se v některých případech objevil jak u genotypů hodnocených jako rezistentní, tak u genotypů náchylných.
Takový výsledek znamená, že testovanou sadu SNP nelze v této fázi považovat za jednoduchý diagnostický nástroj rezistence. Zároveň ale nejde o neúspěch. Naopak to ukazuje, proč je validace markerů nezbytná: asociace nalezená v jednom souboru nemusí automaticky fungovat u geneticky širšího nebo odlišného materiálu.
Závěr
Pilotní ověřování SNP markerů u Brassica oleracea ukazuje, že cesta od genomových dat ke šlechtitelsky využitelnému markeru není automatická. Kandidátní SNP vybrané pomocí GWAS představují slibný výchozí bod, ale jejich praktická využitelnost musí být ověřena na širším souboru genotypů a ve vztahu ke spolehlivým fenotypovým datům.
V této fázi byla testována užší sada 24 kandidátních SNP, zatímco u komplexních znaků, jako je rezistence k chorobám, může být vhodnější využít panely zahrnující několik stovek SNP markerů. Výsledky proto podporují další validaci, případně kombinaci více SNP nebo jiných typů molekulárních markerů. I nejednoznačný výsledek je v tomto procesu cenný — pomáhá rozlišit polymorfismy, které jsou pouze statisticky zajímavé, od markerů, které mohou být skutečně využitelné ve šlechtění.
Výsledek vznikl za podpory Ministerstva zemědělství, institucionální podpora MZE-RO0425.
Autor: Ing. et Ing. Michaela Jungová, Ph.D., DiS.
Národní centrum zemědělského a potravinářského výzkumu, v.v.i., Drnovská 507, 161 06 Praha 6 – Ruzyně