Mrkev obecná setá (Daucus carota subsp. sativus) je naše významná a tradičně pěstovaná kořenová zelenina, jejíž plochy se v ČR pohybují stabilně okolo 900 ha. Z hlediska spotřeby se jedná o naši nejdůležitější kořenovou zeleninu. Její popularita průběžně stoupá, v roce 2021 dosáhla tuzemská konzumace 8,2 kg/osobu, což ji řadí na čtvrté místo za rajčata (12,6), cibuli (12,3) a melouny (8,9 kg).
Z důvodu její cizosprašnosti jsou klasické odrůdy mrkve výsledkem populačního šlechtění, které s sebou vždy nese určitou míru nevyrovnanosti jak v případě liniových tak i hybridních odrůd, pokud vznikají z neustálených hybridních komponent. Snaha o snížení nevyrovnanosti samosprašováním u mrkve vede k tzv. inbrední depresi, která se mj. projevuje výrazným snížením vitality a výnosu. Klasické metody získávání odrůd mrkve jsou navíc časově i finančně náročné z důvodu mnoha generačních cyklů, nutnosti izolace rostlin a negativních důsledků již zmíněné inbrední deprese.
K rychlejšímu ustálení šlechtitelských materiálů mrkve lze v současnosti využít biotechnologické in vitro postupy, založené na indukci haploidů a následně dihaploidů (DH) v prašníkových kulturách. I když se inbrední deprese projevuje i při tvorbě DH, silný selekční tlak během in vitro kultivace a regenerace do velké míry eliminuje neživotné genotypy a umožňuje získat životaschopné rostliny.
V posledních dvou dekádách výzkum v této oblasti akceleroval zejména v Polsku, kde se postupně podařilo v prašníkových kulturách získat dihaploidy jak z embryogenního kalusu, tak i přímo z androgenetických embryí. Obdobný postup je v současnosti zaváděn i v České republice v rámci projektu NAZV QL24010202.
Postup
Zjarovizované výchozí rostliny F1 kříženců mrkve jsou napěstovány a průběžně udržovány ve skleníkových nebo polních podmínkách na pracovišti Výzkumného ústavu rostlinné výroby, v.v.i. v Praze-Ruzyni. Z rostlin jsou na počátku kvetení odebírána celá květenství (okolíky), která jsou následně udržována v nádobách s vodovodní vodou v chladové komoře (3–5°C, fotoperioda 12 hod., světelná intenzita 100 μmol/m2/s) po dobu 4–8 dní před vlastním založením in vitro kultury. Optimální velikost (průměr) poupat pro odběry je stanovována před každým opakováním mikroskopicky tak, aby převažující zastoupení nezralých pylových zrn (tzv. mikrospor) v prašnících bylo ve středně až pozdně jednojaderném – časně dvoujaderném stádiu, kdy vakuola vyplňuje minimálně 50 % objemu mikrospory, ale zároveň ještě nejsou patrná škrobová zrna v cytoplazmě. Před založením prašníkových kultur jsou z květenství odebírány jednotlivé okolíčky i se stopkou a přenášeny do sterilního laminárního boxu. Následuje dvoufázová povrchová sterilizace, nejprve 70% vodným roztokem etanolu po dobu 2 minut, poté 10% roztokem komerčního bělidla (SAVO) na bázi chlornanu sodného po dobu 12 minut (umístění okolíčků v uzavřené 50ml kádince na orbitální třepačce, 200 RPM). V laminárním boxu následují 3 cykly oplachování (5–5–5 minut) ve sterilní, vychlazené destilované vodě. Okolíčky jsou po posledním cyklu ponechány v kádince s destilovanou vodou, z vnějšku průběžně chlazenou ledovou drtí. Poupata jsou z okolíčků odebírána a prašníky izolovány preparační jehlou a jemnou pinzetou pod sterilní binokulární lupou. Prašníky jsou kultivovány na povrchu zpevněného indukčního média IMM v 60mm Petriho miskách. Počáteční kultivace probíhá ve tmě (teplota 27 ± 1°C) až do fáze plně vyvinutých kotyledonárních embryí, regenerujících v místě otevření prašných váčků. Jednotlivá embrya nebo celé prašníky s kotyledonárními embryi jsou poté pasážovány na regenerační médium (REM) v 60mm Petriho miskách a kultivovány při teplotě 18 ± 1°C, světelné intenzitě 300 μmol/m2/s a 16h fotoperiodě. Embrya, regenerující první pravé listy s kořínkem, dlouhým minimálně 30 mm, jsou pasážována na povrch čerstvého regeneračního média v 50ml Erlenmayerových baňkách. Rostliny s dostatečně vyvinutým kořenovým systémem jsou vysázeny do nesterilního rašelinného substrátu a dopěstovány ve skleníkových podmínkách do velikosti kořene o tloušťce 5–10 mm. Je provedena analýza ploidie (flowcytometr), homozygotnosti (molekulární analýzy) a dihaploidní rostliny poté zjarovizovány, přemnoženy a zařazeny do šlechtitelského procesu jako potenciální liniové odrůdy nebo zcela uniformní komponenty hybridních odrůd.
Uplatnění v praxi:
Uvedená metoda má významný praktický dopad na tvorbu liniových i hybridních odrůd mrkve obecné. U získaných materiálů dihaploidního typu máme jistotu absolutní genetické fixace požadovaných znaků a 100% genetickou uniformitu, což značně ulehčuje ne vždy snadnou cestu k registraci nové odrůdy.
Problematika byla podpořena projektem Mze ČR NAZV QL24010202
Ing. Miroslav Klíma, Ph.D., Ing. Hanna Rosokha, Bc. Petra Bartošová, Výzkumný ústav rostlinné výroby, v.v.i.