Uplatnění moderních metod stanovení genetické vzdálenosti v práci s kolekcemi genetických zdrojů

Uchovávání cenných genetických zdrojů rostlin pro pozdější možné využití v oblasti šlechtění, výzkumu a vzdělání se v posledních desetiletích stalo celosvětovou prioritou. S ohledem na rychle se měnící klima a vysoký nárůst extrémních projevů počasí nabývá ještě více na významu. Umožňuje zachování dostatečné genetické diverzity pěstovaných plodin, které pak nejsou až tak zranitelné v prostředí s rychle se měnícími podmínkami.

Podobně jako většina jiných států světa, má i Česká republika Národní program konzervace a využívání genetických zdrojů rostlin a agro-biodiverzity (NP). Široká paleta majoritních a minoritních zemědělských plodin, zelenin, ovocných dřevin, léčivých rostlin, vinné révy a květin je rozdělena mezi odborná pracoviště napříč republikou. Odpovědní kurátoři, specialisté na dané plodiny, zodpovídají za jim svěřené plodinové kolekce. Mezi jejich prioritní povinnosti patři získávání genetických zdrojů domácího původu (odrůdy, staré krajové materiály, šlechtitelský materiál s významnými vlastnostmi), získávání a uchovávání pasportních dat těchto vzorků, realizaci regenerací za účelem namnožení materiálu, popis morfologických, fenologických, výnosových a kvalitativních parametrů, hodnocení odolnosti k abiotickým a biotickým stresům. Z výše uvedeného je jasně patrné, že jde o dlouhodobý proces a kurátoři kolekce musí během této doby především zaručit neměnnost genetického základu uložených vzorků, omezit možnou genetickou erozi na minimum.

Na pracovišti OSEVA PRO s.r.o., o.z. Výzkumný ústav olejnin v Opavě je vedena kolekce genových zdrojů olejnin. Jsou do ní zařazeny početně velké kolekce ozimých a jarních řepek, hořčic bílých, černých a sareptských, máku setého i minoritní řepice, lničky, katrány, rokety a ředkve. Jedná se o plodiny cizosprašné, uchovávají se semena získaná regenerací z technického izolátoru. V posledních letech se i naše pracoviště zaměřuje na zvýšení efektivity práce a kvality uchovávaných materiálů, tvorbou a dodržováním postupů, omezujících riziko genetické eroze. V první řadě je snahou získat nový vzorek v co nejčistší podobě, ideálně přímo od šlechtitele nebo majitele odrůdy. Toto osivo, je-li ho dostatečné množství, posléze putuje do Genové banky v Praze, mnohdy přímo do základní kolekce (z ní se neuvolňuje uživatelům, ale slouží pro potřeby pozdějších regenerací). Pokud je osiva málo, přistupuje kurátor k regeneraci. Osivo nejvyšší dostupné jakosti je vyseto ručně do malých parcel
o rozměrech 1 x 1 m. Ručním setím se eliminují možné příměsi ze secího stroje a také pozemek je vybírán s vyšší pečlivostí s ohledem na možnou přítomnost výdrolu (především u řepek), který by mohl znehodnotit celý proces regenerace. U vzešlého materiálu jsou opakovaně prováděny selekce na přítomnost morfologicky odlišných rostlin ve vzorku. S ohledem na vitalitu budoucího osiva jsou realizovány opakované fungicidní či morforegulační vstupy. V období před začátkem květu je nad parcely umístěna železná konstrukce a na ni technický izolátor z bílé netkané textilie (gramáž 50 g/m²) a izolátor je u země neprodyšně uzavřen nahrnutím půdy. Po odkvětu je izolátor odstraněn, ale kurátor nadále kontroluje stav porostu, zda nedochází ke zmlazování rostlin a tvorbě dalších květů. V plné technické zralosti se semeno sklízí a to opět ručně. Rostliny z parcely jsou srpem odsečeny a bezprostředně uloženy do větší plastové bedny, v níž jsou ručně odsemeněny. Sklizené osivo je uchováváno v označených papírových sáčcích, kde dochází k jeho pozvolnému doschnutí. Čištění osiva je realizováno ručně, pomocí sít nebo malým laboratorním zařízením s bezezbytkovým čištěním. Spolu s ukládaným osivem jsou zaevidována data jako: ECN vzorku, jeho název, inventární číslo skladu v Opavě, stupeň přesevu vzorku a inventární číslo původu, ze kterého byla regenerace množena.

I když je práce s kolekcí vedena s náležitou péčí, není možné zcela vyloučit pochybení, způsobené vlivem lidského faktoru. Doposud nebylo v moci kurátora tento fakt více ovlivnit. S nástupem masivnějšího využití molekulárních metod ale vzniká vhodný nástroj pro kontrolu kvality práce s kolekcemi. V posledních letech jsme se zaměřili na dvě oblasti, ve kterých je využití molekulárních metod velkým přínosem. Jedná se o vyhledávání duplikacích v kolekcích a posouzení kvality regenerací. S ohledem na délku řešení NP a postupné střídání zodpovědných kurátorů existuje riziko, že některý genový zdroj byl do kolekce zařazen dvakrát. Mohlo se tak stát z řady pochopitelných důvodů a to nejen lidskou chybou. Nicméně každá duplikace snižuje efektivitu kolekce a je třeba ji včas odhalit. Doposud kurátor mohl usuzovat na duplikaci na základě stejného názvu, podobných či shodných pasportních dat, shodné morfologie, fenologie a kvalitativních parametrů. Realizací DNA charakterizací a zhodnocením genetické vzdálenosti materiálů můžeme s mnohem větší přesností určit, zda o duplikaci jde, či nikoliv. Podobně porovnáním vzdáleností výchozího materiálu a jeho přesevů je možné ohodnotit kvalitu regenerace, případně stabilitu materiálu.

V roce 2019 byly na pracovišti v Opavě realizovány první DNA charakterizace sporných materiálů z kolekce ozimých a jarních řepek s cílem vyloučení možných duplikací a posouzení genetické eroze při procesu regenerace. Bylo vytipováno sedm dvojic ECN, které nesly shodné nebo velmi podobné označení a shodovaly se i ve velké řadě popisných charakteristik. Materiály byly vysety do nádob a to ve všech, v Opavě uchovávaných, přesevech. Celkem se jednalo o 22 vzorků (Tab. 1). Ve fázi plně vyvinutých děložních lístků byly rostliny odstřiženy a zamraženy při -18°C. DNA byla izolovány pomocí modifikované CTAB-PVP metody, která zaručuje DNA o vysoké čistotě a koncentraci. Jako vhodná metoda byla vybrána analýza ISSR. Celkem bylo použito 5 ISSR primerů (UBC 812, UBC 826, UBC 840, UBC 845 and UBC 880). PCR reakce probíhala v celkovém objemu 15 µl, v 1x reakčním pufru PPP Master Mix (Top-Bio, CZ), 2x BSA, 10 ng primerů a 50 ng templátové DNA. Amplifikace proběhla na termocycleru Bioer za následujícího teplotního profilu: počáteční denaturace 2 min při 95°C, 40 cyklů v profilu 20 s 93°C, 1 min 52°C, 20 s 72°C, konečná elongace 6 min 72°C a chlazení při 4°C. PCR produkty byly separovány a vizualizovány pomocí elektroforézy.

Pomocí 5 ISSR primerů bylo amplifikováno 89 fragmentů, z nichž byla pro každý primer zvlášť vytvořena matice přítomnosti (1) a nepřítomnosti (0). Těchto 5 matic bylo spojeno do jedné, která byla importována do programu MVSP. Pomocí PCO analýzy byla vygenerována matice podobnosti (obr.1). Získaná data byla vyhodnocena a bylo zjištěno, že maximální shoda dosáhla hodnoty 0,933, tj. 93,3% a minimální 0,629, tj. 62,9%. V případě testování duplikací bylo 5 dvojic materiálů determinováno jako shodných (genetická vzdálenost 0,921 - 0,837), dvě dvojice materiálů duplicitu nepotvrdily (0,792; 0,804). V případě regenerací byla hodnocena vzdálenost mezi původním osivem a přesevem u 8 dvojic. Jako uspokojivou regeneraci lze hodnotit 5 regenerací, kde genetická vzdálenost dosáhla hodnot 0,933 - 0,888. Dvě regenerace s větší vzdáleností (0,843 a 0,854) lze hodnotit jako podmínečně úspěšnou, roli zde mohla hrát nehomogenita přesévaného materiálu (šlo o historické materiály, kdy odrůdy řepky ještě nebyly šlechtěny jako čistá linie). Genetická vzdálenost u posledního přesevu dosáhla hodnoty 0,787 a v tomto případě je na zvážení kurátora kolekce, zda by nebylo vhodnější regeneraci zopakovat. Metody DNA charakterizace materiálů jsou jasným přínosem pro kvalitu uchovávaných semenných vzorků genových zdrojů. Je přáním kurátora kolekce, aby se tyto metody staly nedílnou součástí práce a jejich rutinní využití zefektivnilo proces uchovávání materiálů.

Prezentované výsledky byly získány na základě řešení projektů MZe ČR -17253 ”Národní program konzervace a využívání genetických zdrojů rostlin a agrobiodiversity” a institucionální podpory MZE-RO1818.

Tab. 1 Seznam analyzovaných vzorků

Obr. 2 Regenerace jarních brukvovitých plodin pod technickými izolátory

Obr. 3 Sazenice pro výsadbu do regenerací

Autoři: Ing. Andrea Rychlá, Mgr. Lenka Endlová, PhD., OSEVA PRO s.r.o., Výzkumný ústav olejnin Opava, OSEVA vývoj a výzkum s.r.o.